Das Verhältnis zwischen Itachi und Sasuke ist von Brüderlichkeit und Zuneigung geprägt. Die beiden verbringen viel Zeit miteinander und Sasuke bewunderte seinen großen Bruder sehr.[13] Doch mit der Zeit distanziert sich Itachi immer mehr, woraufhin Sasuke mehr und mehr von Fugaku mit seinem Bruder verglichen wird, was ihn unter ziemlichen Leistungsdruck setzt, weswegen er auch anfängt, Itachi als Konkurrenten zu betrachten.[14] Als Itachi nach dem Fund von Shisuis Leiche Besuch von der Konoha-Polizei erhält und diese ihm mitteilten, dass er unter Mordverdacht stünde, zweifelt Sasuke zum ersten Mal an seinem Bruder[1] und als Itachi schließlich von Sasuke nach dem Massaker überrascht wird, sagt er, seine Zuneigung wäre immer nur vorgespiegelt gewesen und Sasuke solle lieber an dem Konkurrenzgedanken festhalten, was dessen weiteren Lebensweg sehr stark prägt.[15]
Es ist allerdings nicht bekannt, warum Itachi seinen kleinen Bruder am Leben lässt.
Nachdem Sasuke sein Training bei Orochimaru "beendet" hat und wieder auf Itachi trifft, erfährt man, dass Itachi das ewige Mangekyō Sharingan besitzen will, um seiner unvermeidlichen Erblindung entgegenzuwirken, was sein Verhalten gegenüber Sasuke erklärt, der ja sein eigenes Mangekyō entwickeln sollte, um dann von Itachi getötet zu werden. Jedoch erweist sich Sasuke als zu stark und Itachi überlebt diese Konfrontation nicht.[16]
Siehe Hauptartikel: Sasuke Uchiha vs Itachi Uchiha